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Il microscopio confocale si riferisce a una sorta di microscopio ottico speciale che può registrare fette ottiche.
Illuminando e osservando un singolo punto di limite di diffrazione, la taglio ottico viene realizzato in un sistema confocale laser. Ciò richiede che i due segmenti di raggio abbiano la stessa attenzione, quindi sono "confocali". Contrariamente alle immagini a campo largo, le immagini confocali non hanno sfocatura. Questo è un vantaggio in sé, perché l'immagine profonda del campione è chiara e ricca di dettagli. Tuttavia, il vantaggio più importante è il suo potenziale di visualizzazione tridimensionale con caratteristiche microscopiche. Dopo che la sequenza di immagini viene acquisita lungo lo stack z, l'oggetto 3D viene ricostruito e visualizzato dal computer.
- Illuminazione confocale
L'illuminazione della sorgente luminosa di punta viene realizzata focalizzando la sorgente luminosa su una piccola apertura (foro stenopeico) e quindi focalizzandola sul campione. Quando l'apertura è abbastanza piccola, il punto di illuminazione è limitato solo dalla diffrazione, non dai parametri geometrici della sorgente luminosa e dell'apertura. La sorgente di luce ordinaria è una grande fonte di luce superficiale, quindi è impossibile focalizzarla sul punto di limite di diffrazione. Pertanto, sebbene la trasmittanza sia molto bassa, questo tipo di luce di illuminazione focalizzata è ancora molto necessaria (per le fonti di luce tradizionali).
Figura 1: illuminazione per imaging confocale. La luce della sorgente luminosa (LS) è focalizzata sul foro stenopeico di illuminazione (PI) e quindi entra nel campione S ..
Il laser come sorgente luminosa ha una collimazione molto elevata (la luce in un buon laser è "estremamente parallela"). Pertanto, il laser può essere focalizzato su un punto limitato a diffrazione attraverso un singolo obiettivo senza usare un foro stenopeico. Pertanto, la maggior parte dei microscopi confocali non ha foro stenopeico di illuminazione. La qualità del punto luce dipende dalla qualità del raggio del laser. Se la qualità non è buona, puoi anche inserire il foro stenopeico di illuminazione. Il laser è generalmente accoppiato al microscopio confocale attraverso la fibra ottica. Queste fibre stesse fungono anche da fori.
La focalizzazione e l'alta densità di energia del laser lo rendono una fonte di luce ideale per il microscopio confocale. La coerenza del laser non è una caratteristica richiesta delle prestazioni confocali. Al contrario, è una sfida per i progettisti ottici, perché causerà modelli di interferenze false, quindi sono necessarie strategie di progettazione attente.
Inoltre, il fatto che il laser tradizionale emetta solo un singolo colore (Laser- "Line") ha i suoi limiti. Nell'imaging e nella misurazione multi-fluorescenza, è necessaria una complessa disposizione multi-laser. Il laser bianco risolve abilmente il problema dell'imaging multicolore.
Figura 2: confronto tra imaging confocale (area destra) e non confocale. Nel trofoblasto di topo colorato di Feulgen. Molte informazioni sulle immagini non confocali non provengono dal piano focale. L'ottica confocale elimina tutti i fattori sfocati e chiarisce la struttura.
Rilevamento confocale
La maggior parte dei rilevatori ha un'area abbastanza ampia (i tubi fotomoltiplici sono di solito diversi centimetri quadrati). L'ottica confocale ha bisogno di rilevare il punto. Pertanto, è necessario eseguire il rilevamento di spot inserendo una piccola apertura (foro stenopeico) nel raggio di luce. Focalizzare la luce del campione sul foro stenopeico, raccogliendo e registrando la luce trasmessa.
Poiché il modello di diffrazione dipende dall'apertura numerica e dalla lunghezza d'onda, è necessario il rilevamento del foro stenopeico. Pertanto, quando questi parametri cambiano, la dimensione del foro stenopeico deve essere regolata.
Quando la lente obiettiva cambia (di solito con il cambiamento di apertura numerica), il moderno microscopio a scansione confocale cambierà automaticamente il diametro del foro stenopeico in modo appropriato. Pertanto, i fori di spillo sono generalmente progettati come aperture a doppio o multistrato.
In effetti, la dimensione appropriata del foro stenopeico dipende non solo dalla lunghezza d'onda e dall'apertura numerica, ma anche dall'ingrandimento interno degli elementi ottici sul microscopio.
Pertanto, non è solo indesiderabile, ma anche sbagliato confrontare direttamente i diametri del foro stenopeico nei microscopi con design diversi. Se il diametro del foro stenopeico non è impostato sul valore ottimale, il sistema non sarà in grado di eseguire la fessura ottica senza intoppi (ovvero trasmettere la sfocatura di defocus) o tagliare l'intensità inutilmente senza ottenere ulteriori qualità di taglio ottico (con conseguente immagini di rumore inutili).
Figura 3: rilevamento nell'imaging confocale. La luce del campione S è focalizzata sul foro stenopeico di osservazione (PO) e quindi sul rivelatore DE.
Percorso ottico della scansione confocale
Il percorso del fascio confocale nel sistema di scansione confocale è solo la combinazione di illuminazione della sorgente di punti e rilevamento dei punti. Questa combinazione può essere usata come coltello ottico. Solo i fotoni dal piano focale possono essere trasmessi al sensore. Mentre tutti i fotoni di altri luoghi sono filtrati. La taglio ottico è realizzato per mezzo del "filtro spaziale".
Poiché solo un punto appare l'imaging "confocale" in un determinato momento, è necessario un dispositivo di scansione per spostare il punto sul campo dell'oggetto in modalità griglia. Di solito, lo specchio ottico è installato sul motore di scansione e utilizzato per eseguire la procedura di scansione. C'è un collo di bottiglia nel tempo necessario per scansionare un telaio completo (di solito) 1.024 linee. I miglioramenti sono stati raggiunti introducendo uno scanner ad alta velocità (scanner di risonanza) che scansiona 8, 000 o più righe al secondo.
Solo sotto la tecnologia del microscopio della luce riflessa può essere raggiunta una buona fetta ottica. Questo è uno dei motivi per il vigoroso sviluppo della microscopia a fluorescenza negli ultimi 20 anni (altri motivi includono l'invenzione di immunocolorazione, ibridazione della DNA, biosensore fluorescente, punti quantici e proteina fluorescente).
Figura 4: da sinistra a destra: 1. Il cono di illuminazione non solo eccita il colorante fluorescente nel piano focale, ma lo eccita su e giù. Qui rappresentato da un doppio cono verde. 2. Il foro stenopeico di emissione intercetta efficacemente la luce emessa da sopra il piano focale. 3. Inoltre, la luce da sotto il piano focale non passerà attraverso il foro stenopeico. 4. Nel sistema confocale, solo la luce del campione raggiungerà il rivelatore. Il rilevamento di fori di spirale respingerà efficacemente qualsiasi luce da altre aree. Infine, si ottiene la vera sezione ottica.
